Maak per gen een qPCR mastermix met daarin per sample:

• 2.85 µL MilliQ water
• 0.5 µL qPCR buffer
• 2.5 µL 2xSensiMix^tm SYBR low-ROX mix
• 0.15 µL genspecifieke primermix (met daarin forward en reverse primers)

Maak genoeg voor 10 samples per mastermix voor elk gen. Voor GAPDH maak je genoeg voor 12 samples, aangezien de no-RT hier ook bij hoort.  

NB: Houd deze volgorde bij het pipetteren aan. 

Meng de qPCR mastermix door een paar keer tegen het epje te tikken (niet centrifugeren) en bewaar op ijs en in het donker zolang je er niet mee pipetteert (SensiMix is lichtgevoelig).

Er mag alleen op de zijkant van de plaat geschreven worden!

Pipetteer, volgens de uitgedeelde sample-indeling, 4 µL cDNA per well in de PCR-plaat.

Als alle koppels de plaat hebben gevuld: laat de gehele plaat goed afsluiten met plakfolie. De assistenten starten het qPCR-apparaat zodra dat vrij is:

• #1  10 minuten bij 95 °C
• #2  40 cycli van: 15 sec bij 95 °C, gevolgd door 40 sec bij 64 °C

NB Lever je cDNA weer in bij de assistent.

Na afloop wordt de qPCR data op Brightspace gezet in de map ‘resultaten qPCR’. Bedenk hoe je de output (Ct = threshold Cycle) kunt omrekenen naar de relatieve genexpressie.

Je kunt deze tabel gebruiken voor het verwerken van de Ct waardes.